光谱学
天然产物分离(2)-纯化技术，概述
最后更新:2022年10月31日|
如何从粗混合物中获得纯化合物:5个关键纯化技术
在此之前,我们展示了从植物和其他生物中制备粗提取物的几个例子。虽然有时(很少)我们很幸运地获得了主要是一种化合物的提取物，但更有代表性的情况是获得了化合物的混合物。例如，这个气相色谱法(GC)对薰衣草油的分析说明了一切，有36种标记化合物(如果你搜索基线，会发现更多)。
在这篇文章中，我们将介绍一些从天然产品提取物中分离和纯化粗混合物的基本技术。
我们想要回答的主要问题是:将原始混合物提纯成其组分有哪些选择?
今天我们将介绍五个关键技术。我们走吧!
目录
1.化学性质(酸碱)
最古老的天然产物分离方法之一(仍在广泛使用)是改变混合物中酸性和碱性分子的pH值，从而改变其水溶性。这是因为某些碱性和酸性分子可以很容易地转化为盐，这大大增加了它们的水溶性。这个过程通常是可逆的，所以当带电荷的盐从混合物中分离出来后，我们可以恢复原来的酸性或碱性物质。
这里是一个大致的概述。
假设你的原始混合物中有一个分子可以作为碱胺例如。大多数都是中性的胺只溶于有机溶剂，如乙醚或二氯甲烷。然而，如果把pH值调整到1左右，那么胺会被质子化，形成铵盐(其共轭酸)．盐，现在带着电荷，然后会有相当大的水溶性，所以提取的混合物水将盐从粗混合物中分离出来。然后可以收集水相，并通过添加碱将pH调整回中性。这将中和酸，引起沉淀胺脱离水相。中性胺可以用有机溶剂提取。
下面是一个有代表性的方案(点击embiggen)
这类天然产物叫做生物碱由于其酸碱性质，是最早被分离为纯分子的分子之一。例如，这是一幅德国化学家的画Friederich Serturner在隔离后和他的朋友出去玩吗啡在1824年。这是艺术家罗伯特•托姆的顺便说一下，这是对场景的重新想象，不是摆拍的肖像。
对于酸性成分，这也适用于相反的方式。例如，可以将粗提取物溶解在有机溶剂中，然后提取强碱(pH值14)。任何具有酸性官能团的成分(如羧酸)都将被转化为它们的共轭碱，所得到的盐将相对溶于水。然后可以将水提取物去除，然后重新酸化以再生母体化合物。然后用有机溶剂进行萃取，使酸分离。
下面是一个有代表性的方案(点击放大)。PDF版本
从粗混合物中分离酸性和碱性成分通常是分离粗天然产品提取物的第一步。如果事先知道想要的化合物是酸性或碱性的，就可以节省大量的纯化时间。
2.沸点差分离(蒸馏)
蒸馏是最常见的净化方法之一:将装有混合物的烧瓶加热至沸腾，蒸汽冷凝并收集。我们用温度计监测蒸汽的温度，并记下每个馏分的沸点。蒸汽的组成是各组分沸点的函数拉乌尔定律(蒸汽压比)。
像薰衣草提取物这样的油是由许多不同的成分组成的，它们的分子量和沸点都不同。理论上，人们应该能够通过蒸馏分离这些成分，对吧?
实际上，使用传统的实验室设备并不容易，除非沸点之间有很好的分离(40°C是一个不错的经验法则)。人们可以通过使用a来增加蒸馏的分离力分馏柱，这导致更多的冷凝-蒸发循环和更好的分离。
[规模也是一个问题。对于少于1毫升的液体，很难进行有效的蒸馏，因为很难均匀地加热液体。在小范围内，有像Kugelrohr这是有帮助的。
如果你想超越“传统的实验室设备”呢?你可以建一个精炼厂。
[那些高塔是蒸馏塔]
毕竟，炼油厂的目的是获取原油，按沸点将其成分分离，然后将所得的部分馏分物作为汽油、柴油、煤油、航空燃料和其他燃料出售(没有蒸馏出来的残留物就是我们所说的“沥青”)。
我们称之为"汽油它实际上是由200多种不同的碳氢化合物组成，从C4到C12，沸点为40-200摄氏度。如果有一个足够大的蒸馏装置，这些组分可以进一步分离成它们各自的组分，如戊烷、己烷、庚烷等，它们被用作精细化学品。
3.结晶
我们都熟悉晶体和再结晶的过程，至少在某种程度上。但是如何利用结晶法从粗糙的混合物中获得纯化合物呢?
这里有一个具有历史重要性的日常例子。检查某些葡萄酒的软木塞或底部会发现类似碎玻璃的微小透明碎片。这些“葡萄酒钻石”实际上是水晶钾ditartrate，慢慢结晶出来的葡萄酒酒精增加的内容。[二酒石酸钾可完全溶于(不含酒精的)葡萄汁，但不溶于乙醇]．因此，重酒石酸盐的晶体从葡萄酒中存在的多种化合物中分离出来。
你可能知道酒石酸盐晶体也很值得注意，因为路易·巴斯德对它们的研究导致了光学异构的发现。
再结晶的一般方法如下:
- 有偿付能力的调查．检查粗混合物的各种可能的溶剂。理想的再结晶溶剂会在高温下溶解整个混合物，而不是在低温下。
- 在高温下溶解粗混合物，直到没有固体剩余。可能需要过滤掉任何不溶性物质。
- 让混合物不受干扰地冷却。较慢的冷却会导致更大的晶体。
如果你幸运的话，你可能会在烧瓶底部看到闪闪发光的晶体。如果没有发生再结晶，刮擦烧瓶可能有助于形成结晶的成核位点。[关于这个名字的起源的传说之一。巴比妥酸之所以这样命名，是因为化学家在结晶盘上刮满头皮屑的胡子(拉丁语为“barba”)有助于它的结晶。化学家向来不讲究卫生。
如果这对你来说都是废话，这是麻省理工学院的一段视频。
另一种方法是向热的、溶解的粗混合物中加入少量的助溶剂，其中某些成分已知是不可溶的。［视频］
直到几十年前，重结晶还是化学家们为数不多的化学纯化和表征方法之一。如果你拿不到水晶，那就算了。［注1］．这可能会导致一些化学家采取孤注一掷的措施。
结晶是你能得到的最接近理想的提纯方法。这些产品通常纯度很高(不像人们有时可以通过蒸馏得到的混合物)，操作简单，相对便宜，而且可以从几毫克到数百公斤(可能更多)。注3］
试图用色谱法净化这么多的物质(见下文)是一场噩梦。
唯一的问题是，并不是所有的化合物都能形成晶体，有时找到能选择性地使一种化合物再结晶的条件是非常耗时的。［注2］
关于结晶，需要注意的另一件重要的事情是，未知化合物的结构可以通过一种称为结晶的技术来确定x射线晶体学．这就是多萝西·克劳福特·霍奇金(Dorothy Crowfoot Hodgkin)如何确定维生素B12的结构，并因此在1964年被授予诺贝尔奖。x射线晶体学是结构测定的黄金标准:除了极少数例外，如果你能使一种化合物结晶，你就能确定它的结构。
并不是所有的有机分子都能形成晶体。这些化合物通常具有一个或多个环的刚性结构，或者是盐。[早期有机化学主要关注类固醇、杂环和生物碱的原因之一是它们相对容易结晶——这在现代色谱技术出现之前非常重要]．在过去，解决分子不能结晶的问题的一种方法是制造诸如腙或亚硫酸氢加合物之类的衍生物，它们通常是结晶的或具有特定的熔点。我们仍然强迫许多本科生学习这些冗长的内容，尽管衍生品的实用性早已过去。
如果你想了解更多关于结晶的信息，Brandon Findlay有一篇很好的文章Chemtips．
我们用一些水晶般的魅力镜头来结束这一节。
4.色谱法
凡是不能轻易通过蒸馏或再结晶提纯的东西，都有柱层析法。说实话，对于大多数在典型的实验室规模(从几毫克到几克的起始材料)工作的实验室化学家来说，柱层析是首选的分离技术。喜欢最好的答案囚徒困境在美国，这可能不是一个理想的解决方案，但至少你通常可以确定它会花费你多少时间。
色谱是如何工作的?我能想到的最好的类比是魔术贴。想象一下用魔术贴“钩子”做成的地毯。然后想象你穿着普通的跑鞋走在上面。没问题，对吧?很平滑!现在想象一下在你的跑鞋底部用魔术贴“绒毛”做衬里，然后做同样的事情。你会走得更慢，还会发出烦人的撕裂声。
在我们的类比中，“魔术贴”表示填充在色谱柱中的(极性)硅胶(“固定相”)，含有自由OH基团，与任何溶解在溶剂中的极性基团(“流动相”)之间的相互作用，因为它们通过色谱柱。化合物的极性基团越多，它与极性硅胶的氢键相互作用就越多，它沿着色谱柱移动的速度就越慢(就像我们的魔术贴例子一样)。”油腻的化合物——那些极性基团很少的化合物——会迅速沿着色谱柱向下移动，因为它们与硅胶的相互作用很少(就像穿着“正常”的鞋子走在魔术贴地毯上一样)。
由于这将变成另一个荒谬的长帖子，我不愿意深入到色谱的太多具体细节，我很高兴向您推荐许多在线资源(例如。Youtube)，你可以在网站上了解如何撰写专栏。布兰登·芬德利来自Chemtips有一系列关于它的文章，我推荐它。
这里有一个写专栏的大致轮廓。
- 使用薄层色谱法(薄层色谱)板，稀释样品的粗混合物被“斑点”，并放置在各种溶剂混合物中，以找到良好的分离可以发生的条件。
- 根据要分离的物料量，选择合适尺寸的色谱柱，用硅胶和起始溶剂(通常是己烷)进行填充。
- 原料被装载在柱的顶部，用最少的非极性溶剂溶解。
- 将洗脱液(TLC实验中确定的溶剂系统“流动相”)添加到柱的顶部，并施加压力。
- 溶剂通过色谱柱并收集在小管中。各种产品的外观是通过薄层色谱(和紫外线灯，如果材料吸收紫外线-很多做!)
- 在确定哪些管含有哪些化合物(通过TLC)后，收集和浓缩馏分，然后通过NMR等光谱学技术进行检查(在以后的帖子中有更多内容)。
一旦你有了一些色谱柱，你就可以在一个小时内完成最简单的纯化(50-100毫克是常见的测试反应)。然而，当材料的数量攀升到>10g级别时，我们就开始寻找其他技术了——在大规模的情况下，运行色谱柱并去除所有溶剂可能需要花费大半天的时间!
最后的注意。在小剂量(少于50毫克)的情况下，尝试一下也很有用制备薄层色谱，这涉及到使用一个更大的板。显影后，可以通过紫外线(如果化合物被紫外线吸收)看到不同的组分，将二氧化硅刮掉，用乙酸乙酯等溶剂从硅胶中去除化合物。这是一张照片．
5.气相色谱(GC)和高效液相色谱(HPLC)
好吧，也许你没有一公斤的原料需要提纯。也许你甚至连1克或10毫克都没有。也许你有一毫克或更少(对于一些天然产品隔离并不罕见!)。不幸的是，上面提到的所有技术都是出．值得庆幸的是，还有一个选择。GC和HPLC来拯救!
GC和HPLC需要昂贵的仪器和大量的时间投资来学习如何使用它们，而且肯定不是所有的实验室都有。然而，为了给出混合物中存在的所有化合物的概述，它们是不匹配的。没有其他技术可以像我在这篇文章顶部对薰衣草油(及其36种化合物)的分析那样得出结果。或者用高效液相色谱法对10微升材料中的萜烯混合物进行分析。看看这种分离。源］．
不需要深入讨论太多细节，这些色谱形式遵循与柱层析(上面)相同的原理，除了“柱”的直径要小得多，并且在明显更高的压力下运行。顾名思义，“溶剂”(流动相)在GC的情况下是惰性气体和液体(通常是己烷/乙腈)以高效液相色谱法为例。
高效液相色谱(HPLC)和气相色谱(GC)除了分离能力强之外，另一个优点是可以在极少量的样品上进行分析。例如，上面的示例是在2上运行的微克。你汗流浃背的指纹比那还重!
如果需要纯样品，可以使用GC和HPLC分离出足够的材料，以便使用更大的色谱柱对化合物进行完全表征。这被称为“制备”GC和HPLC，对小而有价值的样品特别有价值。大约1毫克的物质就足以使用我们的现代光谱技术(主要是核磁共振)完全表征一种未知化合物。
6.结论-纯化技术概述
这是一个很长的帖子。重点是概述了用于提纯粗混合物的关键技术:1)化学性质，2)蒸馏，3)结晶，4)色谱，5)GC/HPLC。
这里有一个方便的表格，总结了每种量表的优点和缺点。这是我个人的意见。欢迎在评论中提出不同意见。
在下一篇文章中，我们将超越这一概述，开始提出以下问题:你如何描述一种纯净的未知化合物的结构?
笔记
注1。我曾经共事过的一位名誉教授告诉我，在19世纪末的德国，攻读博士学位可能需要用浓酸加热各种化合物数天，然后尝试从产生的汤中重新结晶产品。一个完整的博士学位可能就是描述一种反应的产物。
注2。同一位教授还讲了一个故事(可能是一个故事)，一个研究生对他的化合物在无数次尝试后仍然不能结晶感到非常沮丧，以至于他在他的再结晶皿里撒了一泡尿。神奇的是，他想要的化合物的晶体出现了。显然，在实验中被报道为“与尿酸共结晶”。
评论
评论部分